本仪器可以以100%的灵敏度和特异性快速检测唾液、鼻腔标本中的SARS-CoV-2RNA，以及两种不同的SARS-CoV-2变体，因为过程全封闭，所以该仪器能够在非实验室环境中使用。

　　三十多年来，聚合酶链式反应（PCR）一直是分子临床诊断的金标准。 尤其是新冠（COVID-19）爆发以来，qPCR以其特异性强、灵敏度高，为抗击新冠发挥了巨大的作用。 同时，在对实验环境要求高、速度提升有限、体积偏大等方面还有待进一步提升。 这里介绍一种便携的快速PCR检测设备，这种便携快速的PCR设备不到一千克 ，整个检测过程只需要20分钟左右，灵敏度和准确性可以与常规qPCR仪器相媲美。 众所周知，连续的升降温循环是PCR过程的关键部分，也是制约PCR检测时长的部分，在传统的设备中，大多都通过帕尔贴实现，将装有PCR样本的反应管插入金属基座中，帕尔贴通过基座向反应管由外而内的导热。

　　本文介绍的PCR检测仪器最大的创新是采用的等离子体纳米颗粒进行变温扩增，这种加热方式相较于帕尔贴效率更高，通过在每个样品中加入金属等离子体纳米颗粒，使用红外光激发纳米颗粒产生热量来实现加热。这种从反应体系内部产生热源的快速热循环，扩增速度比传统qPCR的快数倍。

　　在反应管中，加入在近红外光作用下（~850 nm）具有局部表面等离子体共振的金纳米颗粒（AuNR）；此波长范围允许使用荧光探针进行实时荧光检测，而不需要去除AuNR。为了驱动热循环，使用三个红外LED(红外发光二极管) 组成变温加热装置，该装置同心环绕置于薄壁 PCR 管周围，在850nm红外光作用下，使用某个特定浓度的AuNR，利用光热效应快速使整个溶液产生热量（体积为20µl）；在每个循环的退火过程，使用小型12V风扇冷却（图1b、1a）。红外LED的强度和时间顺序使用K型热电偶和定制的LabVIEW程序进行校准，该程序被输入到第二个LabVIEW程序中，以自动调整开环控制程序。

　　a, 热循环示意图，AuNR悬浮在0.2ml标准PCR管中的溶液里，快速吸收红外LED发出的光并将其转化为热量，实现快速的PCR热循环。488nm激发光和光谱仪在每个热循环结束时进行测量。

　　b, 仪器布局示意图。PCR管被光学元件环绕，主要组件包括：环绕PCR管的三个红外LED模块、一个冷却风扇，以及一个488nm激光器和光谱仪（见样机图）。温度控制通过带线热电偶的闭环传感或非接触式开环控制来实现。

　　C, 光路示意图。488 nm激光束在到达PCR管之前通过准直透镜和带通滤光片。发射光通过聚光透镜和500nm发射滤光片(Semrock)到达光谱仪。

　　该方案使用了一个激发光源和光谱仪，检测三个荧光探针（FAM、SUN、ROX）（图1c、1d）。为应对近红外波长的AuNRs的等离子体共振，使用由488 nm激光二极管作为激发源和可以检测多个波长的光纤耦合光谱仪组成的荧光装置规避了通道串扰（图1d）。

　　使用插入反应管中的K型线热电偶来监测温度，并在基于LabVIEW的热循环程序中结合比例-积分-微分控制以实现精确的温度设置。该设置实现了初始温度保持2分钟进行逆转录，10秒进行变性，然后进行45个快速热循环循环，总共不到15分钟（图2a）。在45个热循环循环中，该装置实现了约6.7℃的加热速率和4.7℃的降温速率（图2b）。接下来，通过荧光检测纯化的SARS-CoV-2 RNA模板的扩增产物来评估进行RT-PCR 的能力。对于N1和N2引物组，与阴性模板对照（NTC）相比，该方法获得了显著的扩增产物（图2c）。该验证实验在不到 16 分钟的时间内产生了每毫升 5.9×10³个拷贝的检测限(LoD)（图2d）。实验还测试了从有症状的新冠患者身上采集的 14 份唾液样本，发现与实验室的传统qPCR相比，灵敏度为100%，特异性为100%。

　　a，控制良好的温度序列，在＜15 分钟内显示完整的RT-PCR。循环参数包括50℃下2分钟逆转录、95℃下10秒、60到95℃之间的45个循环。

　　实验将多光谱荧光检测器集成到红外热循环装置中，以实时检测荧光信号。首先研究在PCR 过程中反应容器中AuNR对荧光的潜在干扰。在基于实验室的实时热循环仪驱动的PCR反应中，尽管在 AuNR 存在下会发生一些荧光猝灭，但在整个扩增过程的持续时间内仍可以有效地监测荧光，AuNR本身也会不干扰荧光测量。用于扩增唾液中的SARS-CoV-2 DNA（图3a）。定量结果显示，与没有AuNR时计算的 Ct值相比，含有AuNR情况下的Ct值并没有受到影响（图3b）。

　　a，向RT-PCR反应添加AuNR（OD为18）可淬灭原始荧光信号，如通过在QuantStudio仪器上将原始荧光绘制为反应循环数的函数所示。

　　c，使用单个激发激光器和光谱仪实现多光谱检测，以及用于光谱反卷积的多重线扩增通过FAM检测，N2通过SUN检测，RP通过ROX检测。

　　光谱仪收集的全波长光谱允许通过自定义编写的算法进行反卷积。基于系统中的放大和单个目标的荧光测量，将全光谱解卷积为单个峰，这允许使用三个带有FAM、SUN和ROX染料标记的实时探针同时检测三个核酸目标（图3c）

　　通过在每个放大循环后触发激光和光谱仪来实现实时荧光监测。监测加标唾液样本中FAM、SUN和ROX的荧光（图3d）。

　　结合在扩增过程中显示荧光和 Ct 值的结果（图3a,b），确定了AuNR在所选OD浓度为2时猝灭不会影响荧光计在PCR扩增过程中准确检测信号变化的能力。

　　测试表明，尽管纳米粒子的荧光猝灭抑制了整体荧光信号，但在适当的纳米粒子浓度和条件下，使用具有单波长光源的光谱仪可以实现实时、准确和多路复用的荧光读数。

　　PCR检测过程中，免提取检测会大大减少流程，节省时间。实验测试了直接用样本进行扩增，使用定制设计的检测试剂管（试剂盒）计量唾液样本，然后进行PCR检测实验（图4及视频）。经验证，检测管吸管分配精度为9.2± 1.4µl(n =11)（图4d）。免提取扩增检测测试了9份唾液样本（6个阳性和3个阴性）。从样品进到结果出的时间为22-23分钟，与基于实验室的常规qPCR的对比实验中，测试结果对比显示出近乎100%的灵敏度和特异性（图4e）。

　　a, 独特的检测试剂管（φ20.6mm x L142mm），包括主体、反应模块、柱塞和护套。（文末有视频）

　　c, 从样品进到结果出的过程。样本管免提取上机（步骤1）；针对循环数的多光谱荧光值（步骤 2）；用于计算目标的Ct值并确定结果（步骤3）。

　　热循环条件：在45-50℃逆转录 2-5 分钟，然后在 95℃初始变性10-20秒。接下来，在低温（58-60℃）保持0-8秒和高温（91-97℃）保持0-1秒之间循环40-45次。

　　结语：本仪器可以以100%的灵敏度和特异性快速检测唾液、鼻腔标本中的SARS-CoV-2RNA，以及两种不同的SARS-CoV-2变体，因为过程全封闭，所以该仪器能够在非实验室环境中使用。仪器大规模商品总成本预计低于1,000 美元（光谱仪是最贵的组件），至于试剂管（盒）的成本、金纳米颗粒，感兴趣的朋友可以扒一扒。